從上世紀(jì)90年代以來(lái)，借助病毒感染真核細(xì)胞，成為了實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的重要手段。其中，由于慢病毒能感染的細(xì)胞類型廣泛（包括分裂與不分裂細(xì)胞，干細(xì)胞等），可攜帶不低于5 kb的外源基因，并具有穩(wěn)定插入宿主基因組等優(yōu)勢(shì)，成為目前主流的工具病毒。在一些特定的實(shí)驗(yàn)中，我們需要為病毒的濃度，即滴度，進(jìn)行測(cè)定。本文將為大家介紹常用的兩種滴度測(cè)定方法。
一、取舍的問(wèn)題
在正式做實(shí)驗(yàn)之前，不妨先問(wèn)自己這個(gè)問(wèn)題：到底需不需要準(zhǔn)確地測(cè)定慢病毒的滴度？
網(wǎng)上一搜，可以找到許多滴度測(cè)定的方案，也有不少商品化的試劑盒。這些方案各有優(yōu)劣，但基本上都有這樣一個(gè)規(guī)律：越準(zhǔn)確，就越花時(shí)間。越省事的，就越不準(zhǔn)確。但是，準(zhǔn)確度對(duì)我們的實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，到底有多重要呢？
這個(gè)問(wèn)題的答案，其實(shí)是跟我們使用病毒的實(shí)驗(yàn)?zāi)康拿芮邢嚓P(guān)的。如果這批慢病毒是用來(lái)建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)編碼基因或者shRNA等細(xì)胞系的，我覺(jué)得，根本沒(méi)有必要對(duì)病毒的滴度進(jìn)行細(xì)致地測(cè)定。至少我本人在這類情況下，是不測(cè)其準(zhǔn)確滴度的。由于建立穩(wěn)定細(xì)胞系，需要用抗生素篩選或者流式分選的方法，將陽(yáng)性細(xì)胞挑出來(lái)，因此，即使感染效率沒(méi)有達(dá)到100%，也并不要緊。
如果你是包裝和使用慢病毒的新手，本司機(jī)建議在收了粗病毒上清后，分別在3個(gè)10-cm貼壁培養(yǎng)體系（或等同的懸浮培養(yǎng)體系）中，加入0.5、1、2 ml的病毒進(jìn)行感染。后，這其中總有一到兩個(gè)皿滿足使用，也比完整地走一套準(zhǔn)確測(cè)定流程要省事許多。等熟練之后，大致摸清楚了自己的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，以及外源基因長(zhǎng)度和病毒活性滴度之間的關(guān)系，就不用設(shè)3個(gè)感染梯度做實(shí)驗(yàn)了。比如像基于pLKO表達(dá)shRNA這種很短的病毒基因組，在一個(gè)10-cm皿中我只加100-200 ?l。而如果是表達(dá)好幾個(gè)kb的ORF，或者整個(gè)慢病毒質(zhì)粒很大，我可能會(huì)加1 ml甚至更多。
二、快速測(cè)定法
當(dāng)?shù)味葴?zhǔn)確性并不重要時(shí)，我們可以選擇一些快速測(cè)定方案。不過(guò)，目前網(wǎng)上主流的實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)文章，圍繞這部分的內(nèi)容都已相對(duì)陳舊。這其中包括PCR法測(cè)定病毒核酸量，ELISA法測(cè)定病毒外殼蛋白量。雖然相比我后面要講的方法要快上得多，但這些實(shí)驗(yàn)一整套做下來(lái)，依然需要花費(fèi)幾個(gè)小時(shí)。
我目前唯1使用的快速測(cè)定法，是用Clontech的Lenti-X GoStix試紙。它本質(zhì)上也是測(cè)定病毒p24外殼蛋白量的方法，但相比傳統(tǒng)的ELISA法來(lái)說(shuō)，可要方便不少。當(dāng)然，后得到的結(jié)果，也不如ELISA法來(lái)得準(zhǔn)確。只不過(guò)這種不準(zhǔn)確性，是可以接受的。
具體的實(shí)驗(yàn)步驟是，在收獲病毒之前，取20 ?l 293T細(xì)胞培養(yǎng)上清滴到試紙上，再滴加3-4滴Chase buffer，后靜置5-10 min，等試劑均勻在試紙上展開(kāi)后顯色即可。只要在T那里有條帶顯示，就證明慢病毒粗上清達(dá)到可用滴度。
三、準(zhǔn)確測(cè)定法
目前，所有的快速測(cè)定法都是不準(zhǔn)確的，因?yàn)樗鼈兌紱](méi)有考慮慢病毒的活性。也就是說(shuō)，死病毒也會(huì)一并被測(cè)出來(lái)。在一些比較嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)中，比如用慢病毒做RNAi-screening或CRISPR-screening，由于需要嚴(yán)格控制MOI，就需要測(cè)定慢病毒的準(zhǔn)確滴度。
1、熒光報(bào)告基因法
對(duì)于攜帶熒光報(bào)告基因的慢病毒來(lái)說(shuō)，測(cè)定起來(lái)可要簡(jiǎn)單得多。大致的實(shí)驗(yàn)流程是：
在6孔板中，均勻地種入1~3×10^5個(gè)細(xì)胞?？刹坏燃?xì)胞貼壁，直接加入0、5、10、15、20、30 ?l粗病毒。若是純化、濃縮的病毒，則按照濃縮比例，取一點(diǎn)點(diǎn)按比例重新回去，再按上述體積加入細(xì)胞中?？杉尤虢K濃度為2-10 ?g/ml的Polybrene。每孔培養(yǎng)基+細(xì)胞懸液+病毒+Polybrene的總體積為1.5-2 ml。
細(xì)胞貼壁，換液。
第三或第四天，用流式細(xì)胞術(shù)，或者熒光顯微鏡（可用Hoechst 33342染總細(xì)胞），計(jì)算各劑量組帶熒光的細(xì)胞比例，就可以換算出原始的平均病毒滴度。如果第一天加入的病毒是稀釋過(guò)的，記得將算出來(lái)的數(shù)值再乘一下稀釋倍數(shù)。具體的公式就不用啰嗦了吧，小學(xué)初中的數(shù)學(xué)題而已。
值得注意的是，當(dāng)病毒滴度較高時(shí)，很容易在高劑量組中達(dá)到100%陽(yáng)性。這樣的數(shù)據(jù)是不可以參與平均滴度計(jì)算的，因?yàn)檫@代表著，很可能同一個(gè)細(xì)胞感染了2個(gè)甚至更多的活性病毒顆粒。事實(shí)上，當(dāng)陽(yáng)性細(xì)胞百分比超過(guò)50%的時(shí)候，這種多重感染的可能性就比較高了，若直接計(jì)算，就會(huì)低估實(shí)際滴度。遇到這樣的數(shù)值，剔除便是。
用什么細(xì)胞來(lái)測(cè)滴度，也是值得思考的一個(gè)問(wèn)題。雖然網(wǎng)上許多方案用的是293T或者HCT116細(xì)胞作為宿主，但從準(zhǔn)確度而言，我個(gè)人是不推薦的。慢病毒對(duì)不同細(xì)胞的感染能力是有區(qū)別的，而這個(gè)區(qū)別可大可小。我甚至發(fā)現(xiàn)，在同一個(gè)原始細(xì)胞系中分離出來(lái)的兩個(gè)單克隆，對(duì)慢病毒的敏感性還有顯著的區(qū)別。如果慢病毒是要用于諸如screening等要求高準(zhǔn)確度的實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)使用待screening的細(xì)胞作為宿主來(lái)測(cè)定滴度，這樣才能保證終測(cè)出來(lái)的活性滴度，是針對(duì)將要使用的細(xì)胞的。
2、抗生素篩選法
許多慢病毒載體并沒(méi)有熒光報(bào)告基因，只有抗性篩選標(biāo)記，這時(shí)我們只能用抗生素篩選來(lái)測(cè)定滴度了。
可能有的人會(huì)問(wèn)，為何要將抗生素篩選法專門拎出來(lái)說(shuō)？難道跟熒光報(bào)告基因法有很大的區(qū)別嗎？
從原理上來(lái)說(shuō)，兩種方法并沒(méi)有本質(zhì)上的區(qū)別：它們都是計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的比例，從而換算原始的病毒活性滴度。但是，若細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間較長(zhǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞比例的變異度就會(huì)增大。
熒光報(bào)告基因法的實(shí)驗(yàn)流程較短，在感染48~72小時(shí)后，待熒光基因充分表達(dá)，即可測(cè)定。 然而，抗生素法則需要等抗性基因充分表達(dá)后，再加入抗生素篩選數(shù)天，待*殺滅陰性細(xì)胞后，才能進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并換算滴度。無(wú)論開(kāi)始種植的細(xì)胞數(shù)量如何一致、細(xì)胞密度如何均一，人為誤差和生物本身的變異度都是不可避免的。只要時(shí)間一長(zhǎng)，微小的差異就會(huì)顯現(xiàn)出來(lái)，終導(dǎo)致每一組之間換算出來(lái)的滴度數(shù)值變異度增大。
此外，高劑量的病毒會(huì)給細(xì)胞的活性帶來(lái)影響，或正面，或負(fù)面，這跟細(xì)胞本身對(duì)病毒的敏感性，以及所要表達(dá)的外源基因的性質(zhì)，都有密切關(guān)系?？傊?，在較長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的前提下，用高劑量組直接除以不加病毒的對(duì)照組得到的陽(yáng)性細(xì)胞比例，不具有代表性。
Tips：在收獲粗病毒后，建議額外分裝幾支90~100 ?l小體積管，和其他分裝的大體積病毒一并置于-80℃保存。待這些小體積病毒結(jié)冰后，取出來(lái)融化，再測(cè)定滴度。這一步可以模擬一次凍融帶來(lái)的活性滴度下降，這樣后測(cè)得的滴度才是真正具有參考價(jià)值的。
