一、細胞培養(yǎng)基礎(chǔ)和步驟
細胞培養(yǎng)基大全
細胞原代培養(yǎng)步驟
細胞傳代培養(yǎng)步驟
二、細胞培養(yǎng)常見問答
1、加到培養(yǎng)基中的血清 必須滅活嗎？
答：不是必須的，看做什么實驗了。
2、四季青胎牛血清滅活是56 ℃30分鐘嗎？
答：如果用于培養(yǎng)大多數(shù)的腫瘤細胞，血清一般是不需要滅活的，這樣可以有效保存血清中的生長因子 。但是如果用于培養(yǎng)一些表面具有補體受體的細胞，如內(nèi)皮細胞，血清是需要滅活，一般是56 ℃，30 min。
3、我要做滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)，胎牛血清要滅活嗎？
答：進口的一般都已滅活，國產(chǎn)的不一定，hao還是滅活一下再用較安全。
4、我用病毒上清轉(zhuǎn)染細胞，培養(yǎng)用的血清需要滅活嗎？因為血清中可能有些補體和抗體 ，是不是會影響轉(zhuǎn)染？我想未滅活的血清中含些抗體 補體可能會和病毒相結(jié)合，影響轉(zhuǎn)染，正確嗎？細胞是單核細胞白血病細胞，病毒是病毒包裝細胞PT67 收集的病毒上清。為什么要用無血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時，目的是什么？
答：血清一定要滅活，可以先用無血清培養(yǎng)基加病毒孵育幾小時以后再加血清。避免雜蛋白對病毒和宿主結(jié)合過程的干擾，一般是2-6小時，根據(jù)細胞的狀態(tài)決定。血清不一定需要滅活，滅活的目的是將血清中的補體滅活！這要根據(jù)實際情況而定，如果沒有把握那就滅活吧，也不麻煩56度半個小時。
5、(1)我買的是杭州四季青的新生牛血清，要滅活嗎？有些說法是需要，有些說直接解凍后就可以加入到培養(yǎng)基中；我配制胰蛋白酶 液，用的是D-PBS，有關(guān)系嗎？
答：關(guān)于血清的熱滅活，是很多人感興趣也存在一定爭議的話題。大多數(shù)實驗室將血清的熱滅活還是作為常規(guī)來執(zhí)行，因為有兩個作用，第一是滅活補體，第二是滅活血清中可能存在的支原體。但是實驗者并沒有考慮熱處理對血清中的生長因子 、氨基酸 等成分帶來的負面影響。
我在實驗室處理血清的時候，有一次水浴 箱在滅活過程中出現(xiàn)故障，溫度升高到80 ℃，血清變成了凝膠狀，我重新處理了另外一份血清，將兩份血清對比，發(fā)現(xiàn)高溫直接影響到血清所含的抗體蛋白。在56 ℃下滅活半小時以上，肯定也會對里面的蛋白起到破壞作用。下次有機會我做個延長滅活時間的實驗試試，看看到底有多大的影響。熱滅活之后，血清放在四度冰箱久了，就會有沉淀產(chǎn)生，這常常會被認為是微生物污染或者是黑膠蟲污染。為了驗證到底有沒有污染，常常又會把血清放置37 ℃溫育，但是血清中的蛋白會進一步析出，后還是要做鏡檢，無菌培養(yǎng)試驗，和革蘭氏染色試驗，非常麻煩。
我看過一份資料，里面提到70%的實驗者認為滅活是理所當(dāng)然的。常規(guī)滅活建議的溫度在45 ℃到62 ℃之間，而時間則從15分鐘到60分鐘不等。其中chang用的手法是56℃熱處理30分鐘。隨著血清采集、處理、加工工藝的提高，許多早先認為是熱滅活的原因已經(jīng)不再成立，只有少數(shù)對血清進行熱滅活的研究者在實驗中證實了這一步驟的有效性和必要性。
有人比較過11個不同細胞株，發(fā)現(xiàn)其中熱滅活對6 個細胞株(HBAE，MDBK，Vero，成纖維細胞，MRC-5)的生長帶來負面影響，三個細胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受熱滅活的影響，而只有兩個細胞株(Balb/3T3，Sp2/0Ag14 hybrid)，在熱滅活之后，細胞生長有輕微的改善。所以，在正常的操作下，熱滅活通常對細胞的生長沒有明顯的促進作用。
你可以摸索一下，血清從-20 ℃冰箱拿出來之后在常溫解凍，然后混勻分裝成兩份，一份滅活，一份不滅活，比較這兩種血清對細胞是否有影響。然后再確定是滅活還是不滅活。這個過程多也就一個星期。同時你還要考慮血清滅活與否對你后續(xù)的實驗有沒有影響。
(2)分裝后的血清從-20℃取出放4℃讓其液化，卻見血清比較混濁，有沉淀產(chǎn)生，這屬正常嗎？
答：正常。
6、如何選用培養(yǎng)基？
培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，shou選MEM做粘附細胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng)，各種目的無血清培養(yǎng)的shou選是AIM V培養(yǎng)基（SFM）。
7、為什么要熱滅活血清？
加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學(xué)研究、培養(yǎng)ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。
8、L－谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？
L－谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L－谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L－谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有終確定。L－谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。
9、GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？
GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，將其不穩(wěn)定的α－氨基用L－丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L－谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有小的降解，如果在相同條件下，L－谷氨酰胺幾乎*降解。
10、為什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基
11、如何用臺盼蘭計數(shù)活細胞？
用無血清培養(yǎng)基把細胞懸液稀釋到200－2 000個/毫升，在0.1毫升的細胞中加入0.1毫升的0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計數(shù)板計數(shù)細胞?；罴毎懦馀_盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞。
12、如何消除組織培養(yǎng)的污染？
當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。 高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。
1） 在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細胞，稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度。
2 ）分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/ml。
3 ）每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。
4 ）確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2-3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2－3代。
5 ）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代。
6 ）重復(fù)步驟4。
7 ）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6代，確定污染是否以已被消除。
13、培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？
丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源。盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。
14、為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現(xiàn)沉淀？
GIBICO的胎牛血清 沒有預(yù)老化，儲存在2－8 ℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會影響血清的質(zhì)量。推薦在－20 ℃儲存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。
15、目錄上說，Hank's 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？ Hank's 平衡鹽溶液（HBS）和Earle's平衡鹽溶液（EBS）有什么本質(zhì)的功能差別？
HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，碳酸氫鈉的含量在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。
16、Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?
Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執(zhí)行的所有的標準檢驗程序，而且除了這些標準檢測，Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測： End-Point Determination of Endotoxin Content 噬菌體檢驗 生物化學(xué)檢測 激素的檢測 血紅蛋白檢測 Sf9 細胞生長促進及方法學(xué)檢測
17、二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？
二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。
18、制備 lipid-DNA的方法會影響轉(zhuǎn)染效率嗎？
是的。對于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀釋試劑在100 μl OPTI-MEM中，稀釋DNA在100μl OPTI-MEM中?；旌蟽煞N溶液在室溫下孵育15分鐘。對于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允許稀釋的試劑和培養(yǎng)基孵育至少30分鐘可以增加3倍的效率。確保復(fù)合物在沒有血清的情況下形成。孵育15分鐘后，在復(fù)合物中加入含有血清的培養(yǎng)基（800 μl）。（注意以上是35 mm培養(yǎng)皿使用體積）。對于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA應(yīng)該在與脂質(zhì)體混合之前首先與Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步驟允許在一個很小的體積下混合DNA和脂質(zhì)體，接下來可以不需要換培養(yǎng)基的情況下直接加入。對于每一種脂質(zhì)體的詳細的信息可以參考產(chǎn)品說明書。
19、我使用SF900 Ⅱ時，細胞生長良好，但是為什么我的蛋白產(chǎn)物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時效果好？
如果目的蛋白是一個后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達，這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養(yǎng)基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產(chǎn)品保持完好。在無血清配方中，蛋白酶作用的唯1底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物。
20、如何檢測內(nèi)毒素(熱源)水平？
LAL（Limulus Amebocyte Lysate）試驗是可用的敏感和特異的檢測細菌內(nèi)毒素的方法。Levin和Bang 發(fā)現(xiàn)細菌可引起鱟（Limulus polyphemus）血管內(nèi)的凝集作用。內(nèi)毒素啟動一個細胞內(nèi)酶原系統(tǒng)（絲氨酸蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)），通過修飾凝集素，產(chǎn)生一種透明的膠，LAL中的凝固蛋白，從而，形成不可溶的基質(zhì)。LAL試劑緩沖的鱟（血細胞）裂解物。 胎牛血清的內(nèi)毒素檢測是在Grand Island，按照手冊上Gel-clot 方法進行的。在對血清產(chǎn)品進行內(nèi)毒素檢測前，用無熱源的水1：10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘，以消除抑制劑。（通常，血液中的內(nèi)毒素結(jié)合成份的出現(xiàn)會抑制凝膠過程，使內(nèi)毒素不能與LAL反應(yīng)。樣品預(yù)先熱處理可以消除這種抑制作用。）
21、我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養(yǎng)基嗎？
如果使用固體形式的培養(yǎng)基，需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應(yīng)該避免MS培養(yǎng)基的直接滅菌，應(yīng)該高壓滅菌瓊脂溶液，然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養(yǎng)基中。
22、20 ℃下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下PH值會改變嗎？
對于普通使用的緩沖液，pH值隨溫度變化而變化。
24、昆蟲細胞培養(yǎng)的適PH值和滲透壓是多少？
生長培養(yǎng)基的PH值對細胞的增值和病毒或重組蛋白的生產(chǎn)均會產(chǎn)生影響。對于大部分鱗翅類昆蟲細胞系，在PH值 6.0－6.4范圍的大部分應(yīng)用效果良好。培養(yǎng)鱗翅類昆蟲細胞系時，培養(yǎng)基的適滲透壓是 345－380 mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細胞培養(yǎng)方式，減少技術(shù)問題，保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內(nèi)。
25、High Five細胞有任何其它名稱嗎？
High Five細胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。
