1. 引物： 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。
設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：
（1）引物長度： 15-30 bp，常用為20 bp 左右。
（2）引物擴增跨度： 以200-500 bp 為宜，特定條件下可擴增長至10 kb 的片段。
（3）引物堿基：G+C 含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC-好隨機分布，避免5 個以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。
（4）避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。
（5）引物3'端的堿基，特別是末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。
（6）引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列-好有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。
（7）引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1 umol或10～100 pmol，以低引物 量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。
2. 酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U（指總反應(yīng)體積為100 ul 時），濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。
3. dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1 M NaOH或1 M Tris.HCL的緩沖液將其 PH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200 umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。
4. 模板（靶基因）核酸，模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K 來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀； 蛋白酶K 能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯-仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K 法，要防止RNase降解RNA。
5. Mg2+濃度，Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200 umol/L 時，Mg2+濃度為1.5～2.0 mmol/L 為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。
6. 溫度與時間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點。在標(biāo)準反應(yīng)中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90~95℃變性，再迅速冷卻至40 ~60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70~75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100~300 bp 時）可采用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。
（1）變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不*是導(dǎo)致PCR失敗的主要原因。一般情況下，93℃~94℃ 1 min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物*變性，就會導(dǎo)致PCR失敗。
（2）退火（復(fù)性）溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20 個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇適退火溫度的起點較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）＋2（A+T）
復(fù)性溫度=Tm值-（5~10℃）
在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為30~60 sec，足以使引物與模板之間*結(jié)合。
（3）延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：
70~80℃ 150 核苷酸/S/酶分子
70℃ 60 核苷酸/S/酶分子
55℃ 24 核苷酸/S/酶分子
高于90℃時， DNA 合成幾乎不能進行。
PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70~75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時間，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1 Kb 以內(nèi)的DNA-片段，延伸時間1 min 是足夠 的。3~4 kb 的靶序列需3~4 min；擴增10 Kb 需延伸至15 min。延伸進間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。
7. 循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30~40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。
8. 影響pcr特異性的因素：
通過上述內(nèi)容,可以看出有許多因素可以影響pcr的特異性，在此我們作一歸納，供大家參考：
（1）退火步驟的嚴格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。
（2）減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發(fā)及錯誤延伸。
（3）引物二聚體是-常見的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化.
（4）改變MgCl2濃度可以改進特異性，這可能是提高反應(yīng)嚴格性或者對taq酶的直接作用。
一般認為PCR產(chǎn)物應(yīng)在48 h 以內(nèi)完成電泳檢測，有些-好于當(dāng)日電泳檢測，大于48 h 后帶型就會出現(xiàn)不規(guī)則，甚至消失。
