目的

研究基因的表達(dá)和調(diào)控時，需要從組織或細(xì)胞中分離純化RNA。RNA質(zhì)量的高低常常影響RT- PCR、cDNA庫構(gòu)建和Northern Blot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的成敗。

主要試劑

Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。

1. Trizol試劑含有苯/酚，具有毒性和刺激性，注意操作。

2. RNase污染的主要來源是操作過程中手和空氣中的浮沉，注意配帶手套，樣品盡可能蓋嚴(yán)；

3. 細(xì)胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不*會降低最后得率，因?yàn)橐徊糠諶NA會殘留在未裂解的細(xì)胞中。細(xì)胞裂解之后要看不見顆粒狀物質(zhì)（結(jié)締組織和骨除外）。在清洗和裂解細(xì)胞時最好在低溫下操作，防止在操作過程中釋放的內(nèi)源RNase降解了RNA。

4. 酵母和一些細(xì)菌由于細(xì)胞壁的特殊結(jié)構(gòu)，可以加入Trizol試劑同時加入無RNase的玻璃珠并劇烈振蕩，使細(xì)胞裂解充分。

2-8℃ 避光保存一年。

準(zhǔn)備工作

RNA酶（Rnase）是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)。此酶非常穩(wěn)定，在一些極/端的條件下只可暫時失活，但限制因素去除后又迅速恢復(fù)活性。常規(guī)高溫高壓滅菌方法和蛋白抑制劑不能使所有的Rnase*失活。

1.它廣泛存在于人的皮膚上，因此制備RNA時必須戴2.手套RNase的又一污染源是取液器。根據(jù)取液器制造商的要求對取液器進(jìn)行處理。一般情況下采用以DEPC配制的%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部，可基本達(dá)到要求。

3. 塑料制品、玻璃和金屬物品的處理

（1）塑料制品：盡量使用一次性無菌塑料制品。已標(biāo)明RNase-free的塑料制品，如沒有開封使用過，通常不必再處理。

處理的步驟如下：

在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使其終濃度為 0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二乙基焦碳酸酯為活性很強(qiáng)的劇毒物，須在通風(fēng)櫥中小心使用）

將待處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通風(fēng)柜中 37℃ 或室溫下處理過夜。

將DEPC-H2O小心倒入廢液瓶中，將裝有DEPC- H2O 處理過的塑料制品的容器以鋁箔封口，高溫高壓蒸 汽滅菌至少30分鐘。

滅菌塑料制品烘烤干燥，置潔凈處備用。

（2）玻璃和金屬物品250 ℃烘烤3小時以上。

DEPC(二乙基焦碳酸酯)

DEPC是RNA酶的化學(xué)修飾劑,它和RNA酶的活性基團(tuán)組/氨酸的咪唑環(huán)反應(yīng)而抑制酶活性。

DEPC與氨水溶液混合會產(chǎn)生致癌物,因而使用時需小心。

試驗(yàn)所用試劑也可用DEPC處理,加入DEPC至0.1%濃度,然后劇烈振蕩10分鐘,再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC,否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞mRNA活性。

但DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。

實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1. 取50~100mg的組織,加入1 ml Trizol試劑，用勻漿器打勻(Trizol 先放于冰上)。

2. 將勻漿室溫放置5 min。

3. 加入200 μl 氯仿,劇烈震蕩混勻 30s，冰上靜置3 min。

4. 12000 rpm，4℃ 離心15 min。

5. 將上清液小心轉(zhuǎn)移到新的 1.5 ml離心管中（取400 μl ），加入等量體積的異丙醇，上下顛倒幾次混勻，室溫下放置15 min。（此步中注意：不要吸取任何中間層物質(zhì)，寧缺勿爛。）

6. 12000 rpm， 4℃ 離心15 min 。

7. 小心移去上清液，防止RNA沉淀丟失。

8. 用70%乙醇（DEPC處理的水配制）洗滌1次，加入700 μl乙醇，將RNA沉淀彈起，漂洗。（此時RNA是不溶解的）

9. 8000 rpm，室溫離心10min。

10. 盡可能*地吸走上清，防止RNA沉淀丟失。

11. 真空離心干燥3~5分鐘，或放在室溫下使乙醇*揮發(fā)掉。

12. 沉淀用30 μl DEPC-H2O溶解。如發(fā)現(xiàn)沉淀難溶，68 ℃處理10 min。

13. RNA檢測

(1) 測定樣品在260 nm和280 nm的吸光值 按1OD=40 μg/ ml RNA計算RNA的產(chǎn)量。OD260/OD280 在1.8-2.0 。

(2)進(jìn)行甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳,確定RNA的完整性和污染情況。

低得率

A．樣品裂解或勻漿處理不*

B．最后得到的RNA沉淀未*溶解A260/A280<1.65

A．檢測吸光度時，RNA樣品不是溶于TE，而 是溶于水。低離子濃度和低pH條件下，A280值會較高。

B．樣品勻漿時加的試劑量太少。

C．勻漿后樣品未在室溫放置5分鐘。

D．水相中混有有機(jī)相。

E．最后得到的RNA沉淀未*溶解。

RNA降解

A．組織取出后沒有馬上處理或冷凍

B．樣品或提取的RNA沉淀保存于-5－-20℃，未在-60－-70℃保存。

C．細(xì)胞在胰/酶處理時被破壞。

D．溶液或離心管未經(jīng)RNase去除處理。