RNA酶保護(hù)法是一種全新的mRNA定量分析方法。其基本原理是將標(biāo)記的特異RNA探針（32P或生物su）與待測(cè)的RNA樣品液相雜交，標(biāo)記的特異RNA探針按堿基互補(bǔ)的原則與目的基因特異性結(jié)合，形成雙鏈RNA；未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待測(cè)目的基因與特異RNA探針結(jié)合后形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化，故該方法命名為RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)。

　　目錄

　　· 一、 RNA酶保護(hù)試驗(yàn)的介紹

　　· 二、試劑準(zhǔn)備

　　· 三、操作步驟

　　· 四、電泳與放射自顯影

　　· 五、注意事項(xiàng)

　　RNA酶保護(hù)試驗(yàn)是通過液相雜交的方式，用反義RNA探針與樣品雜交，以檢測(cè)RNA表達(dá)的技術(shù)。

　　一、 RNA酶保護(hù)試驗(yàn)的介紹

　　RNA酶保護(hù)試驗(yàn)（RNase Protection Assay，RPA） 是通過液相雜交的方式，用反義RNA探針與樣品雜交，以檢測(cè)RNA表達(dá)的技術(shù)。與Northern blot和RT-PCR比較，RPA有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：

　　1. 檢測(cè)靈敏度比Northern雜交高。由于Northern雜交步驟中轉(zhuǎn)膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進(jìn)行電泳，故損失小，提高了靈敏度。

　　2. 由于PCR擴(kuò)增過程中效率不均一和反應(yīng)“平臺(tái)"問題，基于PCR產(chǎn)物量進(jìn)行分析所得數(shù)據(jù)的可靠性將下降，而RPA沒有擴(kuò)增過程，因此，分析的數(shù)據(jù)真實(shí)性較高。

　　3.由于與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進(jìn)行分析。

　　4.步驟較少，耗時(shí)短。與Northern雜交相比，省去了轉(zhuǎn)膜和洗膜的過程。

　　5. RNA-RNA雜交體穩(wěn)定性高，無探針自身復(fù)性問題，無須封閉。

　　6. 一個(gè)雜交體系中可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)探針雜交，無競爭性問題。

　　7. 檢測(cè)分子長度可以任意設(shè)置，靈活性大。

　　RPA的缺點(diǎn)是需要同位素標(biāo)記探針。

　　二、試劑準(zhǔn)備

　　1. GACU POOL：取100mM ATP.CTP.GTP各2.78μl.100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。

　　2. 雜交緩沖液:PIPES 0.134g.0.5M EDTA（pH8.0） 20μl.5M NaCl 0.8ml.甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。

　　3. RNase消化液：5M NaCl 120μl.1M Tris-HCl（pH7.4） 20μl.0.5M EDTA（pH8.0） 20μl.RNase A（10mg/ml） 8μl.RNase T1（250U/μl） 1μl，加DEPC H2O至2ml

　　三、操作步驟

　?。ㄒ唬?反義RNA制備

　　可由含T7或SP6啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒為模板制備，也可以用含啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物為模板制備，本文介紹后者。

　　1.設(shè)計(jì)含T7啟動(dòng)子的PCR引物

　　由于PCR產(chǎn)物將作為合成反義RNA的模板，所以一對(duì)引物中的下游引物5’-端要含T7啟動(dòng)子序列: T7啟動(dòng)子序列為：5’-TAATACGACTCACTATAGGG

　　引物設(shè)計(jì)的其他要求與一般PCR引物的設(shè)計(jì)相同。PCR產(chǎn)物的長度決定了反義RNA探針的長度，具體設(shè)計(jì)時(shí)可考慮100-400bp長。最好采用巢式PCR，即先擴(kuò)增出一較長的片段，再以該片段為模板擴(kuò)增出較短的片段，以保證探針的特異性，

　　2.PCR 先用上游引物和下游引物Ⅰ進(jìn)行PCR，再以PCR 產(chǎn)物為模板，用上游引物和下游引物Ⅱ-T7進(jìn)行二次PCR。

　　3.探針合成標(biāo)記與純化

　　在0.5ml 離心管中加入下列試劑：

　　RNasin （40U/μl） 0.5μl

　　GACU POOL GAC

　?。ê珿TP.CTP.ATP各2.75 mM，UTP 61μM） 2μl

　　[α-32P]UTP（10μCi/μl） 2.5μl

　　DTT （二硫蘇糖醇，0.1M） 1μl

　　5×轉(zhuǎn)錄 buffer 2μl

　　模板（50ng/μl） 1μl

　　T7 RNA 聚合酶 （15U） 1μl

　　混合后，短暫離心，37℃保溫1hr。

　　加入DNaseⅠ（10U/μl） 1μl， 37℃ 15min， 然后75 ℃ 10min以滅活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。

　　加入：飽和酚 50μl

　　氯仿 50μl

　　酵母tRNA（2μg/μl） 4μl

　　DEPC H2O 100μl

　　室溫下充分混勻，離心10000g×2min。取上層液置另一0 .5ml離心管中，加入100μl氯仿，混勻，離心10000g×2min。將上層液轉(zhuǎn)移至另一0.5ml 離心管中，再加入3M NaAc 10μl，預(yù)冷無水乙醇250μl，混勻后，-20℃靜置30min。4℃離心13500g×10min。棄上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗滌，4℃離心13500g×2min， 棄上清液。室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇。加入50μl雜交緩沖液溶解沉淀，4℃下保存待用?？捎媚蛩?聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)探針質(zhì)量。

　　（二） 雜交

　　1.RNA提取后溶解在雜交緩沖液中，濃度為1μg/μl。

　　2.取8μl RNA加入1-3μl探針（根據(jù)探針檢測(cè)結(jié)果調(diào)整） 于0.5ml 離心管中。

　　3.80℃保溫2min，然后40-45℃下雜交12-18hr。

　?。ㄈ?消化

　　1.雜交管于37 ℃保溫15min，加入RNase消化液，37 ℃保溫30min。

　　2.加入10%SDS 10μl.10μg/μl蛋白酶K 20μl，混勻，37 ℃保溫10min。

　　3.加入65μl飽和酚和65μl氯仿，混勻，室溫離心，10000g×2min。

　　4.轉(zhuǎn)移上層液到另一0.5離心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl異丙醇，混勻后，置-20℃ 30min，4 ℃離心，135000g×10min。

　　5.棄上清液，室溫下?lián)]發(fā)乙醇，加入5-8μl上樣緩沖液溶解沉淀。

　　四、電泳與放射自顯影

　　（一） 配制凝膠：（50ml）

　　40%丙烯酰胺-亞甲雙丙烯酰胺（19：1） 6.25ml

　　5×TBE 10ml

　　尿素 24g

　　加H2O至50ml

　　溶解后加入25%過硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混勻，注入電泳槽中，插入梳，待膠凝固。

　?。ǘ?預(yù)電泳（50ml）

　　以1×TBE為上下槽電泳緩沖液，加上電壓后進(jìn)行預(yù)電泳，如果用測(cè)序電泳裝置，電壓應(yīng)達(dá)2000v以上，功率設(shè)定為100w，溫度設(shè)為50 ℃。待膠板溫度達(dá)50 ℃時(shí)，暫停電泳，準(zhǔn)備加樣。

　?。ㄈ?加樣

　　將已溶解在加樣緩沖液中的樣品80 ℃加熱2min，立即加樣到膠孔中，電泳1-2hr。（電泳條件同預(yù)電泳） 。

　?。ㄋ模?電泳結(jié)束

　　電泳結(jié)束后，打開膠板，用濾紙取下膠，覆上一層保鮮膜，放置于暗盒中，暗室紅光下，壓上一張X片，蓋上暗盒，-70℃曝光1-3天。暴光結(jié)束后，將X光片顯影.定影.水洗.晾干。

　　五、注意事項(xiàng)

　　1.本實(shí)驗(yàn)大部分為RNA操作，注意RNA酶的污染。

　　2.RNase消化液消化未雜交的單鏈RNA和探針RNA，當(dāng)探針與樣品之間有堿基錯(cuò)配時(shí)，錯(cuò)配位點(diǎn)也將被消化，因此會(huì)產(chǎn)生片段較小的雜交片段。因此進(jìn)行PCR時(shí)，采取盡量減少錯(cuò)配的措施。

　　3.同位素對(duì)RNA合成有一定影響，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生非全長的探針。因此，標(biāo)記時(shí)間不宜過長。

　　4.RNase消化液有時(shí)會(huì)產(chǎn)生過度消化而無檢測(cè)信號(hào)，可以將消化液稀釋10-100倍后使用。